冷冻电镜是个啥,它到底有多牛?什么原理( 二 ) _是个

1974年，加州大学伯克利分校的Robert Glaeser和他学生Ken Taylor 首次提出冷冻电镜，并测试了冷冻含水生物样品的电镜成像，目的在于降低高能电子对分子结构的损伤，并因此实现高分辨成像。

文章插图
揭开生物分子的原子层面纱1975年，这一年距离电子显微镜诞生已有40年左右时间，其应用在“死”物质里如火如荼，在生物学领域却被普遍认为“不适用” 。强电子束、真空腔，这些环境使得生物样品注定被破坏。
然而，亨德森在细菌视紫红质(bR，能吸收光能)上的尝试，证明了电子显微镜在生物领域的适用性。
亨德森将未脱离细胞膜的细菌视紫红质直接放置在电子显微镜下进行观察，借助表面覆盖的葡萄糖防止真空干涸，并采用强度更低的电子束流，得出细菌视紫红质在细胞膜上是规整排列且朝向一致。之后，在前述Aron Klug等人提出的三维重构技术的基础上，亨德森和同事获得了细菌视紫红质较为粗糙的三维立体结构图像。这也是历史上第一张膜蛋白领域的三维结构。
这张图像的分辨率达到7埃(?，相当于0.7纳米)，已经是当时电子显微镜获得的历史最佳蛋白图像。但亨德森的目标是分辨率达到3埃左右，这一清晰水平才能和此前的X射线晶体学成像大致相当。

文章插图
15年后，也就是1990年，亨德森再次对外发布了分辨率达到原子层面的细菌视紫红质立体图像，这一突破性成果有力证明了用电子显微镜进行生物分子成像的潜力。
如果说亨德森坚定选择了高分辨率观察生物大分子这条路，那么约阿基姆?弗兰克(Joachim Frank)则是冷冻电镜单颗粒分析的鼻祖，耗费十余年时间完成单颗粒三维重构算法及软件Spider 。同样是在1975年，弗兰克(Joachim Frank)开始思考如何对电子显微镜获得的二维平面模糊图像进行分析和叠加处理，最终得到更高分辨率的三维立体图像。
1981年，弗兰克完成了一种算法，利用计算机识别图像把相同蛋白质的不同影子收集起来，并且将轮廓相似的图像进行分类对比，通过分析不同的重复模式将图片拟合成更加清晰的2D图像。在此基础上，通过数学方法，在同一种蛋白质的不同2D图像之间建立联系，以此为基础拟合出3D结构图像。弗兰克的图形拟合程序被认为是冷冻电镜发展的基础。
雅克?迪波什(Jacques Dubochet)的重要贡献则是在真空环境下使生物分子保持自然形状。几乎是在同期的1978年，迪波什开始解决电子显微镜领域的样品干涸并遭破坏的问题。如前所述，亨德森在细菌视紫红质成像是曾用葡萄糖来保护样品，但这种方法并不普遍适用。

文章插图
迪波什得出的方法是对生物样品进行玻璃化(vitrifying water) 。一般情况下，通过氢键的相互作用，水分子会在凝固过程中形成有序排列，形成晶体。而迪波什想到的即是在水分子相互作用之前就让其凝固，将生物样品浸入事先经液氮冷却的乙烷中，就能使水迅速冷却、在数毫秒之内完全凝固，这种方式得到的就不是晶体而是无定形态，而玻璃也是处于无定形态，玻璃化名称由此而来。生物样品嵌在无定形冰中，堪称留下了真实的一瞬间。
1982年，迪波什开发出真正成熟可用的快速投入冷冻制样技术制作不形成冰晶体的玻璃态冰包埋样品。1984年，迪波什首次发布不同病毒的结构图像。
至此，相对容易地使用电子显微镜观察生物大分子的要素基本集齐。